高选择性重组基因工程菌治理含汞废水

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1 实验材料


实验中所用的菌株为厦门大学化学工程与生物工程系生物工程实验室利用大肠杆菌E.coliBL21(DE3)为宿主菌，经带有汞操纵子基因和金属硫蛋白编码基因的重组质粒转化而得到的基因工程菌。汞操纵子基因在细胞膜处表达出高特异性的外膜汞结合蛋白和内膜汞转运蛋白，同时金属硫蛋白基因在细胞体内表达出对重金属有高结合能力的金属硫蛋白。金属硫蛋白是一组富含巯基的低分子量蛋白质，它既可高容量地结合重金属离子，又可在细胞体内消除重金属离子对细胞本身的毒害作用。为便于重组菌株的筛选，在重组质粒中引入了氨苄(Amp)和卡那(Kan)两种抗生素选择性标记。


基本培养基为LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0；酵母提取物5.0；NaClO。


2 实验方法


2.1菌种保存


在500mL摇瓶中将重组菌接种到200mL含50mg/L氨苄霉素和30mg/L卡那霉素的LB培养基中，在37℃下振荡培养至OD600约为4(振荡速率为170min)，在1.5mL无菌微型离心管中加入870 L细菌培液中和130 L88%的甘油，混合后用液氮速冷，然后保存在-80℃。


2.2汞离子的生物富集


在l000mL摇瓶中装入300mLLB培养液，加入50mg/L氨苄霉素和30mg/L卡那霉素，然后接入lmI细菌～甘油培养液，在37℃下振荡(振荡速率为170rain)培养至过夜.取少量菌液接种到相同的LB培养液中，使初始菌体密度为OD400值0.1～0.3，37℃下振荡培养至OD6000.5～0.7时添加诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1.0mM.再次振荡培养4h，4℃下离心收获菌体待用.菌体在使用前先用磷酸缓冲液洗涤，然后悬浮于含不同浓度汞离子的模拟电解废水中，在37℃下振荡培养1h，离心收集菌体。为测量菌体内所富集的汞离子含量，将收集的菌体干燥后用70%的高纯度硝酸溶液消化过夜。考察富集速率时，在不同的时间用0.2 m孔径的醋酸纤维膜收集菌体，以使菌体和处理液尽快分离开来。由于重金属离子易于被容器器壁吸附而导致实验误差，实验中所用的所有导管和玻璃容器使用前都用20%的硝酸溶液浸泡过夜，然后用去离子水浸洗干净。


3 结论


经重组基因转化的基因工程菌具有很强的从废水中富集汞离子的能力。废水中共存离子的存在加快了重组菌的富集速率，但却导致菌体的平衡富集能力下降了30%。pH的变化对重组菌的富集行为影响很小，且重组菌对汞离子的富集能力比一般的生物吸附法有很明显的提高。




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